Blog

Jun 23, 2023

ARNm administré par voie intradermique

Nature Génie biomédical

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

29 000 accès

4 Citations

281 Altmétrique

Détails des métriques

Le succès des thérapies à base d'ARN messager dépend en grande partie de la disponibilité de systèmes de délivrance qui permettent la traduction sûre, efficace et stable du matériel génétique en protéines fonctionnelles. Ici, nous montrons que les vésicules extracellulaires (VE) produites par nanoporation cellulaire à partir de fibroblastes dermiques humains et l'encapsulation de l'ARNm codant pour le collagène de type I de la matrice extracellulaire α1 (COL1A1) ont induit la formation de greffes de collagène-protéine et réduit la formation de rides dans le collagène. tissu dermique appauvri de souris à la peau photovieillie. Nous montrons également que la livraison intradermique des véhicules électriques chargés d'ARNm via un réseau de micro-aiguilles a conduit à la synthèse et au remplacement prolongés et plus uniformes du collagène dans le derme des animaux. L'administration intradermique d'ARNm COL1A1 à base d'EV peut constituer une thérapie efficace de remplacement des protéines pour le traitement de la peau photovieillie.

Les développements récents des techniques de modification de l'ARN messager ont amélioré l'efficacité thérapeutique de l'administration d'ARNm et son potentiel pour des applications cliniques à court terme, y compris la thérapie de remplacement des protéines et la vaccination contre le virus du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1, 2. Cependant, l'incapacité intrinsèque et l'immunogénicité potentielle des ARNm nécessitent qu'ils soient encapsulés dans des véhicules de délivrance. Les modalités actuelles de délivrance d'ARNm sont centrées sur l'utilisation de transporteurs de nanoparticules lipidiques (LNP) pour l'encapsulation et le transport3,4. Cependant, les LNP posent plusieurs défis majeurs, notamment la cytotoxicité, la mauvaise biodistribution, le manque de spécificité de cible et l'immunogénicité. Ces problèmes peuvent être causés par la nécessité d'une PEGylation de surface (PEG signifie poly(éthylène glycol)) des LNP pour améliorer leur demi-vie circulatoire et réduire la clairance non spécifique5,6. Notamment, l'administration de PNL chez les personnes a été liée à l'anaphylaxie, à l'hypersensibilité et aux événements indésirables auto-immuns7,8. Par conséquent, l'identification de porteurs d'ARNm capables de surmonter certains de ces défis associés à la LNP serait utile pour le développement ultérieur de thérapies à base d'ARNm.

Les vésicules extracellulaires (EV), y compris les exosomes et les microvésicules, jouent un rôle majeur dans le transport des biomolécules et des acides nucléiques, y compris les ARNm, dans le corps humain9,10,11. En conséquence, ces dernières années, les véhicules électriques sont devenus des vecteurs prometteurs pour les thérapies à base d'acides nucléiques en raison de leur biocompatibilité intrinsèque, de leur capacité à franchir les barrières physiologiques et de leur faible immunogénicité12,13. Contrairement aux LNP, les EV, y compris les exosomes, sont produits de manière endogène par les cellules du corps et entraînent des niveaux inférieurs de réponses inflammatoires. De plus, des stratégies pour produire facilement et à moindre coût de grandes quantités d'exosomes ont été développées. Nous avons précédemment signalé une méthode de nanoporation cellulaire (CNP) dans laquelle des pores nanométriques transitoires ont été créés à la surface des cellules sources pour permettre le chargement à grande échelle d'ARNm de transcription complète dans les EVs14 sécrétés. Ici, en utilisant un modèle murin de photovieillissement aigu qui imite étroitement les caractéristiques physiopathologiques de la peau endommagée par le vieillissement chez l'homme15, nous montrons l'utilité de la thérapie par ARNm COL1A1 à base d'exosomes pour remplacer la perte cutanée de protéines de collagène en tant que traitement anti-vieillissement pour le photovieillissement. peau. Pour améliorer l'efficacité de la livraison et de la rétention de l'ARNm, nous montrons également que la livraison de l'ARNm de collagène via un patch de micro-aiguille d'acide hyaluronique (HA) (COL1A1-EV MN) permet une distribution plus efficace de l'ARNm dans le derme, résultant en un collagène durable. -greffe protéique et dans un traitement amélioré des rides de la peau photovieillie.

L'atrophie dermique due à une perte irréversible de collagène est une caractéristique du vieillissement cutané16,17. De nombreuses méthodes ont visé à restaurer la perte de protéines de collagène dans la peau, allant des approches en vente libre et pharmaceutiques (antioxydants18,19,20, rétinoïdes21, peptides22,23) aux dispositifs médicaux (c'est-à-dire la thérapie au laser24 et les produits de comblement dermiques synthétiques25,26) . Cependant, aucune de ces technologies existantes n'a été en mesure d'obtenir un remplacement à long terme du collagène endogène pour maintenir la force, la fermeté et l'élasticité de la peau au fil du temps27,28,29. Stimuler les fibroblastes responsables de la synthèse des protéines de collagène peut également être un moyen efficace de contrôler à court terme le vieillissement cutané30. Cependant, les fibroblastes perdent progressivement leur capacité à proliférer et à synthétiser le collagène à mesure qu'ils vieillissent, ce qui complique les méthodes à plus long terme de remplacement du collagène pour le traitement anti-âge31. Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à remplacer la protéine de collagène dans un modèle d'épuisement du collagène photovieillissement via la livraison d'ARNm médiée par EV. Pour générer des véhicules électriques chargés d'ARNm de collagène humain I alpha I (COL1A1), nous avons utilisé une technique CNP qui impliquait de plaquer une monocouche de fibroblastes dermiques humains néonataux (nHDF) sur une surface nanoporeuse et de nano-transfecter les cellules avec un plasmide COL1A1-GFP ( Fig. 1a et Fig. 1a supplémentaire)14. Les véhicules électriques ont été isolés des milieux de culture le lendemain de la transfection. Les cellules traitées au CNP se sont avérées avoir un nombre EV par cellule 10 fois supérieur à celui des cellules traitées par électroporation en masse standard (BEP), qui a été réalisée à l'aide d'électrodes parallèles de type cuvette comme décrit précédemment32, ou de nHDF non traités en culture (Fig. 1b). Les véhicules électriques produits par chaque méthode étaient caractérisés par une distribution de taille culminant à environ 150 nm de diamètre, déterminée par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et 80% d'intensité dans le pic de mode par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 1c et Supplémentaire Fig. 1b, c) avec un indice de polydispersité (PDI) de 0,12 à 0,25. Les expériences de Western blot ont montré que les expressions des biomarqueurs d'exosomes (CD9, CD63, TSG101) et de microvésicules (ARF6) dans le groupe traité au CNP étaient significativement plus élevées que dans le groupe non traité, confirmant l'augmentation des EV sécrétés (Fig. 1d supplémentaire). Les analyses cinétiques ont en outre montré que la libération d'EV optimisée en tension culminait 8 h après l'induction du CNP, avec une sécrétion continue notée au cours des 24 h suivantes (Fig. 1e, f supplémentaires). L'amplification en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT – qPCR) a montré que les EV sécrétés par CNP contenaient plus de 200 fois l'ARNm de COL1A1 que les EV sécrétés par BEP et 3 000 fois plus d'ARNm de COL1A1 que les EV sécrétés par des cellules non transfectées (Fig. 1d ). L'évaluation par bioanalyseur du gel d'agarose a démontré l'ARNm COL1A1 transcrit sur toute la longueur à environ 4 000 nucléotides (Fig. 1e). Les véhicules électriques préparés par CNP présentaient une stabilité structurelle lorsqu'ils étaient stockés pour une administration préclinique à 4 ° C sans changement d'apparence, de membrane et de propriétés de taille lorsqu'ils étaient évalués par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), microscopie à force atomique (AFM) et NTA (Figure supplémentaire . 2a–c). De plus, l'ARNm de COL1A1 encapsulé dans les véhicules électriques était stable à la fois à température ambiante et à 4 ° C, et présentait également une stabilité sérique, soulignant ainsi leur potentiel d'utilité clinique future (Fig. 2d, e supplémentaire).

a, Représentation schématique des véhicules électriques générés par le CNP pour la délivrance ciblée d'acides nucléiques. b, nombre d'EV par cellule produit par des nHDF non traités dans du tampon PBS comme contrôle, BEP ou CNP avec tampon PBS uniquement en 24 h (n = 3 pour chaque groupe ; *P = 0,048 Contrôle vs BEP ; **P = 0,005 Contrôle vs CNP ; ##P = 0,002 BEP contre CNP). c, Caractérisation des véhicules électriques par analyse de suivi des nanoparticules. d, RT – qPCR de l'ARNm de COL1A1 révèle que les EV produits par CNP contiennent des quantités d'ARNm transcrites beaucoup plus importantes que les EV produits par les groupes BEP et Control en 24 h (n = 3 pour tous les groupes ; **P = 0,002 Control vs BEP ; * **P < 0,001 Contrôle vs CNP ; ###P < 0,001 BEP vs CNP). e, Électrophorèse sur gel de l'ARN total extrait de 3, 78 × 108 EV produits à partir de CNP à l'aide du plasmide COL1A1-GFP par rapport à l'ARNm synthétique COL1A1 transcrit in vitro comme témoin. f, Prolifération des nHDFs après traitement avec différentes concentrations de protéines de COL1A1-EVs à 0 h, 24 h et 48 h (n = 4 pour tous les groupes ; à 24 h : #P = 0,0107, 10 µg ml−1 vs 0 µg ml -1 de la concentration protéique des COL1A1-EV après traitement ; ##P = 0,002, 20 µg ml-1 vs 0 µg ml-1 ; ###P < 0,001, 30 µg ml-1 vs 0 µg ml-1 ; à 48 h : *P = 0,045, 10 µg ml−1 vs 0 µg ml−1 de traitement COL1A1-EV ; ***P < 0,001, 20 µg ml−1 vs 0 µg ml−1 ; ***P < 0,001 , 30 µg ml-1 contre 0 µg ml-1). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem. Des tests t de Student bilatéraux ont été utilisés pour les comparaisons en b et d. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons en f. Le schéma dans un a été créé avec BioRender.com.

Pour évaluer le potentiel thérapeutique des EV contenant l'ARNm de COL1A1 (COL1A1-EV) in vitro, nous avons traité des fibroblastes en culture avec des COL1A1-EV pendant 48 h (Fig. 3a supplémentaire). Il a été observé que la prolifération des fibroblastes augmentait avec le traitement COL1A1-EV de manière dose-dépendante (Fig. 1f). Après le traitement, une expression élevée de la protéine COL1A1 a été observée dans les fibroblastes traités avec les EV-COL1A1, comme en témoigne la co-localisation accrue de la protéine fluorescente verte (GFP) avec COL1A1 sous microscopie à immunofluorescence. En revanche, les niveaux de COL1A1 étaient nettement inférieurs sans co-localisation de la GFP dans le groupe non traité (Extended Data Fig. 1a, b). L'administration réussie d'ARNm dans les cellules réceptrices a été confirmée par une expression élevée d'ARNm de collagène et des niveaux de protéines de collagène mesurés par PCR quantitative et analyse Western blot, respectivement, dans des fibroblastes traités avec des COL1A1-EV (données étendues Fig. 1c, d et supplémentaires Fig. 3b) . De plus, le pro-collagène I, un précurseur de la protéine COL1, a été significativement augmenté après le traitement COL1A1-EV, indiquant une amélioration de la synthèse de la protéine COL1 par les fibroblastes traités par EV par rapport aux fibroblastes non traités (Extended Data Fig. 1e). L'imagerie par microscopie confocale de l'absorption cellulaire des véhicules électriques a indiqué que la livraison de cargaison de véhicules électriques dans les cellules réceptrices est médiée par l'endocytose médiée par la clathrine (Fig. 3c, d supplémentaires) et est capable de s'échapper des lysosomes (Fig. 4 supplémentaires). Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'ARNm COL1A1 fonctionnel peut être encapsulé de manière stable dans les véhicules électriques par CNP et que ce système de livraison COL1A1-EV peut augmenter de manière significative l'expression de la protéine COL1A1 in vitro.

Pour comprendre la cinétique de l'administration d'ARNm COL1A1 médiée par EV et de la formation de protéines in vivo, nous avons livré 2,7 × 109 nombre de copies d'ARNm COL1A1 COL1A1-EV dans le derme de souris via une seringue à aiguille à insuline. Les souris ont été tuées au cours des 14 jours suivants pour une analyse histologique par RNAscope pour la quantification de l'ARNm de COL1A1. L'ARNm de COL1A1 s'est avéré significativement élevé dans le tissu cutané local 12 h après l'accouchement, avec des diminutions notables observées à 24 h et 48 h après l'injection, et un retour aux niveaux d'ARNm de COL1A1 de base à 96 h (Fig. 2a, b). La traduction in vivo de l'ARNm de COL1A1 en protéine a été évaluée par microscopie à immunofluorescence de tissu explanté sur une période de 30 jours. Des greffons immunocolorés GFP + COL1A1 + ont été observés dès 12 h après l'injection, avec un pic de fluorescence à 4 jours après l'accouchement (Fig. 2c – e). Il a été observé que les greffes de protéines GFP + COL1A1 + diminuaient de manière dépendante du temps du jour 4 au jour 30 après l'injection, comme observé par microscopie par immunofluorescence, la majorité des protéines dérivées de COL1A1-EV se retournant au jour 30. Ces résultats démontrent que des doses plus faibles de l'administration de COL1A1-EV entraîne un pic de 3 à 4 jours de la protéine COL1A1 dans les tissus receveurs, diminuant aux niveaux de référence au jour 30 après l'injection.

a, Hybridation in situ de l'ARNm de COL1A1 humain par RNAscope après injection intradermique de COL1A1-EVs et contrôle salin, mesurée à 12 h, 24 h, 48 h, 96 h, 7 j, 10 j et 14 j après injection. Barre d'échelle, 100 µm. b, Quantification des résultats RNAscope par nombre moyen de points bruns par cellule. c, Immunofluorescence au fil du temps de la protéine dérivée de COL1A1-EV par visualisation de la GFP co-localisée et de la protéine COL1A1 (RFP). Barre d'échelle, 100 µm. d, quantification de l'intensité de fluorescence de l'expression de la protéine COL1A1-GFP. e, La quantification des cellules GFP + confirme que les greffes de protéines dérivées de COL1A1-EV diminuent de manière dépendante du temps sur 30 jours. Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem

Le photovieillissement dermique est caractérisé par la destruction du collagène et des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) de la peau par l'exposition au soleil et l'irradiation UV, ce qui provoque la formation de rides33,34. Pour évaluer la capacité des EV d'ARNm COL1A1 à remplacer la protéine de collagène dégradée in vivo, nous avons utilisé un modèle de photovieillissement décrit précédemment dans lequel des souris nues athymiques ont été traitées avec une irradiation UV (311 nm) sur une période de 8 semaines, entraînant des rides dermiques secondaires au collagène. déplétion35 (Fig. 5a supplémentaire). L'efficacité du traitement d'irradiation UV de 8 semaines dans la dégradation des fibres de collagène et d'élastine dans la peau murine a été confirmée par une analyse histologique et tissulaire (Fig. 5b – g supplémentaire). Nous avons ensuite évalué le potentiel thérapeutique des COL1A1-EV pour remplacer le collagène dermique chez les souris irradiées aux UV en traitant les animaux avec un cycle d'injection 5x de l'un ou l'autre : (1) 2,7 × 109 nombre de copies d'ARNm COL1A1 encapsulé dans les EV (COL1A1-EV) , (2) 2,7 × 109 nombre de copies d'ARNm de COL1A1 encapsulé dans des nanoparticules lipidiques (COL1A1-LNP), (3) EV témoins sans chargement de cargaison CNP (EV déchargés), (4) traitement topique à l'acide rétinoïque (RA) à 0,05 % ou ( 5) contrôle salin. La formation des rides a été suivie aux jours 0, 4, 7, 14, 21 et 28 après le début du traitement, et tous les animaux ont été tués au jour 28 pour des analyses d'histologie et de répliques de plâtre 36 (Fig. 3a). La photographie microscopique des rides cutanées du derme au cours de la période de traitement a montré une diminution modeste du nombre et de la surface des rides au jour 28 pour les groupes COL1A1-LNP, EV non chargés et acide rétinoïque par rapport au groupe témoin salin (Fig. 3b). En revanche, les souris photoâgées traitées avec les COL1A1-EV ont présenté une réduction du nombre et de la surface des rides à partir du jour 7 après le début du traitement, avec une réduction significative à partir du jour 14 à des niveaux similaires à ceux observés chez les témoins fictifs non irradiés (Fig. 3c, d ). Des répliques de plâtre cutané de la peau dorsale prises au jour 28 après le début du traitement ont confirmé l'efficacité des COL1A1-EV pour le traitement de la peau photovieillie par rapport au témoin salin, à l'acide rétinoïque, aux témoins EV déchargés et aux COL1A1-LNP (données étendues Fig. 2). De manière notable, les COL1A1-LNP ont également présenté une réduction du nombre et de la surface des rides par rapport au contrôle salin, à l'acide rétinoïque et aux contrôles EV déchargés, bien que cet effet n'ait pas été aussi prononcé qu'avec les COL1A1-EV. La peau traitée avec les COL1A1-EV et les COL1A1-LNP a également démontré une élasticité et une fermeté plus élevées, mesurées respectivement par un cutomètre et un extensomètre Instron (Fig. 6 supplémentaire).

a, Représentation schématique et chronologie de 5 injections à faible dose de COL1A1-EV (2,7 × 109 nombre de copies d'ARNm COL1A1 par dose). Le tissu cutané a été prélevé à 28 jours. b, la formation de rides a été suivie aux jours 0, 4, 7, 14, 21 et 28 après l'administration initiale de COL1A1-EV, COL1A1-LNP, EV déchargés, 0,05 % d'acide rétinoïque (AR) ou de solution saline (n = 4 pour tous les groupes ). Le groupe fictif comprenait des souris nues femelles qui n'étaient pas exposées à une irradiation UV. Barre d'échelle, 5 mm. c, Nombre total de rides dorsales de la peau quantifiées avec un logiciel personnalisé (n = 4 pour tous les groupes ; ※※P = 0,0016 COL1A1-EVs vs Saline au jour 7 ; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline au jour 14, 21 et 28 ; **P = 0,0089 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 21 ; **P = 0,0097 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 28 ; #P = 0,461 EV déchargés vs Saline au jour 21 ; ##P = 0,0034 Déchargé EV vs solution saline au jour 28                      0,0142 RA vs solution saline au jour 21                                                0069 d, Quantification de la zone des rides sur la peau dorsale (n = 4 pour tous les groupes ; ※※P = 0,0063 COL1A1-EVs vs Saline au jour 7 ; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline aux jours 14, 21 et 28 ; **P = 0,0082 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 21 ; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 28 ; ††P = 0,0040 RA vs Saline au jour 28 ; ##P = 0,0018 EV déchargés vs Saline au jour 28). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en c et d. Le schéma dans un a été créé avec BioRender.com.

Pour évaluer les effets secondaires immunogènes des COL1A1-LNP et COL1A1-EV, la peau traitée a été excisée d'un sous-groupe d'animaux et analysée pour l'inflammation 24 h après l'injection. La peau traitée avec les COL1A1-LNP présentait des rougeurs et un gonflement par rapport aux témoins fictifs et à la peau traitée avec les COL1A1-EV (données étendues Fig. 3a). La cytométrie en flux et l'immunodosage enzymatique (ELISA) des tissus ont en outre révélé un infiltrat leucocytaire massif dominé par des neutrophiles dans les tissus ayant reçu des COL1A1-LNP (données étendues Fig. 3b, c) et des niveaux élevés de cytokines inflammatoires telles que TNF-α, IL- 6, IL-1β et IFN-γ (données étendues Fig. 3d – f). En comparaison, les tissus ayant reçu le traitement COL1A1-EV n'ont pas présenté de forte réaction inflammatoire. Ces résultats suggèrent que les LNP sont nettement plus immunogènes que les EV.

Après évaluation au jour 28, un sous-ensemble d'animaux a été retenu pendant 4 semaines supplémentaires pour surveiller la durée de réduction des rides. Les rides dermiques ont réapparu dès 1 semaine plus tard, à partir du jour 35 après le début du traitement, et au jour 56, les rides dermiques étaient statistiquement indiscernables des niveaux de pré-traitement (données étendues Fig. 4).

Pour évaluer la greffe de collagène dermique à partir de l'administration de COL1A1-EV, la peau a été excisée de tous les groupes au jour 28 après le début du traitement et évaluée par microscopie par immunofluorescence, ainsi que par coloration au trichrome de Masson. L'analyse histologique et la quantification de l'intensité de la fluorescence ont révélé que l'expression de la protéine COL1A1 était significativement restaurée après le traitement par COL1A1-EV par rapport aux autres groupes (Fig. 4a, b). La coloration au trichrome de Masson a confirmé des niveaux plus élevés de coloration du collagène et d'épaisseur dermique (197,95 ± 24,46 μm COL1A1-EVs vs 95,19 ± 10,66 μm Saline au jour 28, P < 0,001) chez les souris ayant reçu COL1A1-EVs que chez les souris ayant reçu une solution saline témoin, acide rétinoïque, EV déchargés ou COL1A1-LNP (Fig. 4c, d).

a, coloration par immunofluorescence pour la protéine GFP et COL1A1 (RFP) dans le groupe témoin fictif, le groupe témoin salin, le groupe de traitement RA, le groupe de traitement EV non chargé, les groupes de traitement COL1A1-LNP et COL1A1-EV. Les souris traitées par COL1A1-EV présentaient des greffes de protéine GFP+ COL1A1 dans le derme et sous-cutané 28 jours après le début du traitement. Barre d'échelle, 200 µm. b, Intensité de fluorescence de la protéine COL1A1 (RFP) pour tous les groupes de traitement (n = 3 pour tous les groupes ; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline ; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Saline ; #P = 0,0386 EVs déchargés vs Saline ; †P = 0,0218 RA vs Saline ; +P = 0,0255 COL1A1-EVs vs COL1A1-LNPs). c, Coloration représentative au collagène trichrome de Masson de l'épiderme, du derme et de la sous-cutanée pour tous les groupes de souris. Le collagène est bleu. Barre d'échelle, 200 µm. d, Quantification de l'épaisseur dermique montrant une augmentation des fibres de collagène dans le groupe COL1A1-EVs (n = 3 pour tous les groupes ; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline ; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Saline ; #P = 0,0437 EVs déchargés vs Saline ; †P = 0,0447 RA vs Saline ; +++P < 0,001 COL1A1-EVs vs COL1A1-LNPs). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem Une ANOVA à une voie a été utilisée pour les comparaisons en b et d.

Comme il a été constaté que les rides revenaient aux niveaux de base chez les animaux photovieillis dans le mois suivant l'arrêt du traitement COLA1-EV, nous avons ensuite cherché à améliorer la durée du remplacement des protéines et l'efficacité de la greffe de collagène en concevant une formulation de micro-aiguilles HA (COL1A1-EV MN) pour améliorer la livraison de tissu d'ARNm médiée par EV. Des patchs de micro-aiguilles personnalisés ont été préparés en utilisant une méthode de micromoulage dans laquelle les COL1A1-EV ont été mélangés avec une solution à 15% de HA dissous dans du PBS et coulés dans les pointes d'un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS) en maintenant un vide pendant 30 min, après quoi 1 ml de 15% en poids de solution HA a été placée dans le micromoule, puis transférée à 4 ° C pendant 4 h pour la solidification (Fig. 5a). Chaque aiguille du patch de micro-aiguilles COL1A1-EV a été moulée dans une forme conique, avec un diamètre circulaire de 400 µm à leur base et une hauteur de 1 000 µm (Fig. 5b). La résistance mécanique des patchs avec 10%, 15% ou 20% HA chargés d'EV a été évaluée avec une machine d'essai de traction (Fig. 7a supplémentaire). La force de rupture de charge de notre 15% COL1A1-EV MN a été confirmée comme étant supérieure à la force moyenne minimale nécessaire pour la pénétration cutanée (0,058 N)37 (Fig. 7b supplémentaire). La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) a confirmé que les micro-aiguilles pénétraient à travers la couche cornée dans le derme (516 ± 76 μm)38 (Fig. 5c). Les COL1A1-EV chargés dans des micro-aiguilles HA se sont avérés avoir une apparence et une intégrité de la membrane stables, évaluées par microscopie électronique à transmission (TEM) et AFM, ainsi qu'une distribution stable de l'ARNm et de la taille des particules de COL1A1 (Fig. 7c – f supplémentaires). Pour la livraison dans les tissus, les patchs COL1A1-EV MN ont été pressés dans la peau dorsale des souris, et la base de la micro-aiguille a été retirée après 15 min (Vidéo supplémentaire 1). Pendant cette période, les micro-aiguilles se sont complètement dissoutes, sans irritation cutanée visible ni marquage au site d'administration (Fig. 5d et vidéo supplémentaire 2). Pour comparer la distribution tissulaire des VE délivrés par micro-aiguille avec celle des VE délivrés par seringue à insuline, les VE ont été marqués avec DiI (perchlorate de 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine ; Beyotime, C1036)39 et administré par voie intradermique sous la peau dorsale des souris receveuses, avec évaluation histologique ultérieure par microscopie à immunofluorescence (Fig. 5e et Supplémentaires Fig. 8a, b). L'analyse de la distribution tissulaire a révélé que l'injection à l'aiguille de la seringue entraînait une administration inégale des véhicules électriques avec agglutination dans des zones spécifiques du derme et de la sous-cutanée, tandis que les véhicules électriques délivrés par micro-aiguille étaient mieux dispersés dans le derme et la sous-cutanée (Fig. 5f et Supplémentaire Fig. 8c, d) . L'évaluation de l'intégrité de la membrane EV par cryo-EM a montré moins de lyse de la membrane EV dans les EV livrés avec le patch microneedle par rapport à l'aiguille de la seringue (18,1 ± 3,0% COL1A1-EV MN vs 28,3 ± 2,4% injection à l'aiguille, P = 0,022) (Fig supplémentaire .8e,f). Pour évaluer si la distribution tissulaire améliorée et la protection de la membrane EV ont entraîné une meilleure prise de greffe EV, nous avons ensuite utilisé l'imagerie par fluorescence in vivo en série d'EV marqués au DiI injectés par voie intradermique chez des souris sur une période de 14 jours. L'imagerie par fluorescence a confirmé un signal DiI EV similaire entre les EV délivrés par seringue et les EV délivrés par micro-aiguille pendant les 4 premiers jours après l'injection. Cependant, le groupe de micro-aiguilles COL1A1-EV avait un signal de fluorescence significativement plus élevé au jour 4 (69,61 ± 6,4 % COL1A1-EV MN vs 45,79 ± 2,5 % injection à l'aiguille, P < 0,001) et au jour 7 (35,78 ± 5,9 % COL1A1-EV MN vs 19,38 ± 3,8 % injection à l'aiguille, P < 0,001), durant jusqu'au jour 10 après l'injection (30,22 ± 2,6 % COL1A1-EV MN vs 6,68 ± 1,3 % injection à l'aiguille, P < 0,001) (Fig. 5g, h). Les analyses de distribution d'organes ex vivo de la fluorescence de la sonde DiI sur une période de 2 semaines ont révélé une distribution tissulaire et une dégradation du signal similaires chez les animaux recevant une injection intradermique et les animaux recevant une micro-aiguille, suggérant que la réduction de l'intensité du signal est due au métabolisme de la sonde DiI comme indiqué dans d'autres études similaires40,41 (Fig. 9a, b supplémentaires). Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'utilisation du patch à micro-aiguille améliore la rétention à long terme des véhicules électriques dans les tissus.

a, Illustration schématique de la fabrication de micro-aiguilles. b, Images au microscope et au microscope électronique à balayage de réseaux de microaiguilles. Barre d'échelle, 500 µm. c, la section colorée au H&E de la peau de la souris montre la pénétration d'une seule micro-aiguille. Barre d'échelle, 100 µm. d, en haut : évolution dans le temps des pointes de micro-aiguilles HA EV enfoncées dans la peau ; les microaiguilles se sont dissoutes dans les 15 minutes suivant l'application. Barres d'échelle, 200 µm. En bas : la récupération de la peau après le traitement par micro-aiguille HA EV montre une irritation minimale. Barres d'échelle, 5 mm. e, L'histologie cutanée des véhicules électriques marqués au Dil montre des véhicules électriques hautement concentrés (rouges) répartis de manière inégale dans la sous-cutanée après l'injection d'une aiguille de seringue, tandis que les véhicules électriques délivrés par micro-aiguille étaient répartis plus uniformément dans les tissus. Des lignes pointillées jaunes encerclent des bulbes pileux sous-cutanés représentatifs et bordent des portions représentatives en forme de tige du follicule s'étendant vers le haut jusqu'au derme. Barre d'échelle, 100 µm. f, distribution EV représentative analysée par le logiciel ImageJ. g, images de fluorescence in vivo de souris nues traitées par injection intradermique ou livraison de patchs à micro-aiguilles HA d'EV marqués au Dil les jours 1, 2, 4, 7, 10 et 14 après l'accouchement (n = 3 pour tous les groupes). h, Quantification de l'intensité de fluorescence sur la période de traitement de 14 jours. Les données sont normalisées à l'intensité de fluorescence au jour 1. Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem *** P < 0,001 COL1A1-EV Groupe de livraison MN vs groupe de livraison à l'aiguille. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en h. Le schéma dans un a été créé avec BioRender.com.

Nous avons ensuite testé si l'utilisation de notre patch de micro-aiguille COL1A1-EV personnalisé pour délivrer des COL1A1-EV pouvait entraîner un remplacement amélioré des protéines in vivo dans la peau de souris photovieillies (Fig. 10 supplémentaire). Des souris athymiques ont de nouveau été soumises à une irradiation UV de 8 semaines et assignées à 1 des 5 groupes de traitement : (1) contrôle salin, (2) EVs d'ARNm COL1A1 délivrés par une aiguille de seringue, (3) contrôle de micro-aiguille HA, (4) EVs non chargés délivrés par Micro-aiguille HA (micro-aiguille EV non chargée) et (5) EV chargés d'ARNm COL1A1 délivrés par micro-aiguille HA (COL1A1-EV MN). Toutes les souris ont reçu une injection à dose unique de 22 × 109 copies d'ARNm de COL1A1 (ou un volume de véhicule équivalent pour les groupes témoins) au jour 0 du calendrier de traitement. Après l'injection, toutes les souris ont été surveillées par photographie microscopique des rides dorsales de la peau pendant jusqu'à 3 mois (Fig. 6a). Par rapport à l'injection d'aiguille de seringue, qui a réduit la formation de rides jusqu'à 35 jours avant un retour à la ligne de base de pré-traitement, l'administration d'ARNm COL1A1 par COL1A1-EV MN s'est avérée réduire considérablement la zone et le nombre de rides jusqu'à 70 jours avant un retour aux niveaux de base (Fig. 6b, c). Pour confirmer davantage ces résultats, un sous-ensemble de souris de chaque groupe a été tué à 1 mois, 2 mois et 3 mois après le traitement pour l'évaluation du plâtre de réplique cutanée de la peau dorsale et de l'histologie (données étendues Fig. 5a – c). Les traitements par injection à l'aiguille et COL1A1-EV MN ont réduit la longueur et la profondeur des rides jusqu'à 1 mois après le traitement (données étendues Fig. 5d, e). Cependant, seules les souris traitées avec COL1A1-EV MN ont montré des réductions significativement durables de la longueur et de la profondeur des rides jusqu'à 2 mois. Pour tester si le remplacement du collagène et le traitement des rides pouvaient être maintenus plus longtemps, nous avons soumis des cohortes d'animaux supplémentaires à un traitement en série de COL1A1-EV délivrés par aiguille de seringue et micro-aiguille tous les 30 jours. Il a été constaté que les COL1A1-EV administrés par aiguille de seringue et COL1A1-EV MN réduisaient le nombre et la surface des rides aussi longtemps que les animaux recevaient le traitement, les animaux COL1A1-EV MN démontrant la plus grande amélioration (données étendues Fig. 6).

a, observation à long terme (91 jours) de 4 groupes de traitement après une seule injection : (1) contrôle salin, (2) COL1A1-EV (22 × 109 numéro de copie de l'ARNm COL1A1) délivrés par une aiguille de seringue 28G, (3) HA contrôle de la micro-aiguille, (4) EV déchargés délivrés par micro-aiguille HA (micro-aiguille EV déchargée) et (5) COL1A1-EV MN (22 × 109 nombre de copies ARNm COL1A1), (n = 4 pour tous les groupes). Barre d'échelle, 5 mm b, Quantification du nombre total de rides (n = 4 pour tous les groupes ; *P = 0,014 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 7 ; *P = 0,038 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 14 ; * P = 0,012 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 21                         0,039 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 28 ; *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 35 ; *P = 0,03 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 42 ; *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 49 ; *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 56 ; **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 63 ; #P = 0,030 injection à l'aiguille vs solution saline au jour 7   ; #P = 0,041 injection à l'aiguille vs solution saline au jour 14 ; †P = 0,047 micro-aiguille HA vs solution saline au jour 14). c, Quantification de la surface totale des rides de la peau dorsale (n = 4 pour tous les groupes ; *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 7 ; *P = 0,038 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 14 ; *P = 0,042 COL1A1 -EV MN vs solution saline aux jours 21 et 28 ; *P = 0,026 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 42 ; *P = 0,048 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 49 ; #P = 0,033 Injection à l'aiguille vs solution saline au jour 7 ; #P = 0,031 Injection à l'aiguille vs solution saline au jour 14 ; #P = 0,042 Injection à l'aiguille vs solution saline au jour 21). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en b et c.

L'analyse histologique des échantillons de peau prélevés après le traitement a confirmé la prise de greffe durable de la protéine GFP + COL1A1 dans le derme et sous-cutané des souris dans le groupe d'injection à l'aiguille et dans le groupe de micro-aiguilles COL1A1-EV 1 mois après l'accouchement (Fig. 7a). Cependant, au bout de 2 mois, seules les souris de la cohorte de micro-aiguilles COL1A1-EV ont démontré une prise de greffe GFP + COL1A1 dans le derme et sous-cutané (Fig. 7b). Trois mois après l'accouchement, les échantillons de peau de tous les groupes n'ont présenté aucune greffe de collagène GFP (Fig. 7c). L'intensité de l'immunofluorescence COL1A1 + GFP a été quantifiée, confirmant les résultats de la microscopie des rides qui ont démontré un traitement efficace aux jours 30 à 60 et un retour à la ligne de base avant le traitement des jours 70 à 90 (Fig. 7d). La coloration immunohistochimique de la protéine COL1A1 et la coloration au trichrome de Masson des tissus cutanés ont confirmé que la quantité de collagène dans le derme était corrélée aux résultats de la microscopie par immunofluorescence et que parmi toutes les cohortes, le groupe COL1A1-EV MN avait les fibres de collagène les plus abondantes et l'épaisseur dermique la plus élevée (180,14 ± 21,46 μm COL1A1-EV MN vs 96,61 ± 14,00 μm Saline à 1 mois, P < 0,001 ; 154,88 ± 8,27 μm COL1A1-EV MN vs 109,25 ± 10,86 μm Saline à 2 mois, P < 0,05) (Fig. 7e,f ) . Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'encapsulation et l'administration de l'ARNm de COL1A1 via notre système COL1A1-EV MN peuvent prolonger le remplacement des protéines de collagène dans la peau photovieillie pendant plus de deux fois la durée de l'administration de l'aiguille de la seringue.

a – c La coloration par immunofluorescence de GFP et COL1A1 (RFP) démontre des greffes de protéines COL1A1 GFP-positives dans la peau de souris recevant des COL1A1-EV via une injection d'aiguille 28G et via COL1A1-EV MN jusqu'à 1 mois (28 jours) après l'accouchement. À 2 mois (63 jours), seules les souris traitées avec COL1A1-EV MN avaient une greffe COL1A1 positive à la GFP à long terme. Aucune preuve de protéine de collagène GFP-positive n'a pu être détectée chez les souris dans les 3 mois (91 jours) après l'accouchement. Barre d'échelle, 200 µm. d, la quantification du signal de fluorescence co-localisé GFP et COL1A1 (RFP) démontre une greffe de collagène dérivé de COL1A1-EV à long terme dans la peau de souris ayant reçu COL1A1-EV MN par rapport à des souris ayant reçu COL1A1-EV via une injection à l'aiguille 28G et des groupes témoins ( n = 3 pour tous les groupes ; ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs injection à l'aiguille à 2 mois). e, Coloration immunohistochimique de la protéine COL1A1 et coloration au trichrome de Masson à 1 mois (28 j), 2 mois (63 j) et 3 mois (91 j). Barre d'échelle, 200 µm. f, Quantification de l'épaisseur dermique par coloration au trichrome de Masson (n = 3 pour tous les groupes ; **P = 0,0062 COL1A1-EV MN vs Saline à 1 mois ; *P = 0,034 COL1A1-EV MN vs Saline à 2 mois). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± sem Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en d et f.

Les vésicules extracellulaires sont devenues un système d'administration de médicaments de nouvelle génération en raison de leurs propriétés inhérentes de biocompatibilité, de leur faible immunogénicité et de leur capacité à dériver de cellules humaines saines12. Néanmoins, la plupart des études portant sur la délivrance d'acides nucléiques ont jusqu'à présent encapsulé de petites molécules dans la gamme 10-20 nt telles que les microARN et les petits ARN interférents (siARN) comme charge utile, tandis que les acides nucléiques plus gros tels que les ARNm sont rarement évalués en raison de la difficulté à les charger dans les VE42. Avec les récents progrès dans l'utilité des thérapies à base d'ARNm pour le traitement des maladies humaines, il y a eu un intérêt accru pour l'utilisation des véhicules électriques comme système de délivrance d'ARNm. Récemment, nous avons développé une technique de chargement d'ARNm qui permet la production à grande échelle d'EV contenant de l'ARNm endogène intact pour la thérapie aux acides nucléiques14. Ici, nous avons montré que les véhicules électriques chargés d'ARNm peuvent être appliqués pour la thérapie de remplacement des protéines dans un modèle de photodéplétion du collagène dermique17. Nous avons montré que le CNP est capable de charger un nombre élevé de copies d'ARNm de COL1A1 (~ 4 000 + nt) dans les véhicules électriques, ce qui ne peut pas être réalisé par les méthodes de chargement post-insertion43,44. Les résultats in vivo ont montré que ces COL1A1-EV peuvent restaurer l'expression de la protéine COL1A1 dans la peau de la souris après le photovieillissement. Nous avons également examiné la présence d'ARNm et de protéines COL1A1 au fil du temps in vivo et avons constaté que la protéine correspondante était traduite dès 12 h après l'accouchement avec un pic à 4 jours et que cela se maintenait pendant plusieurs semaines, selon la dose. Plusieurs études ont généré la protéine COL1A1 ex vivo en tant que charge de collagène ; ici, nous avons caractérisé la cinétique in vivo de la livraison de l'ARNm exogène de COL1A1 et de l'expression des protéines in vivo45.

Pour adapter notre approche pour le remplacement des protéines à long terme, nous avons développé un réseau de micro-aiguilles pour la livraison de COL1A1-EV afin de permettre une distribution uniforme des EV dans les tissus locaux, avec une rupture réduite de la membrane. L'HA est un élément essentiel de la matrice extracellulaire et il a été vérifié qu'il a une excellente biocompatibilité avec les tissus cutanés et divers systèmes de biomatériaux46,47. En intégrant des véhicules électriques dans un biomatériau de microaiguille HA, nous avons pu étendre la greffe de protéines de COL1A1 à plus de 60 jours dans les échantillons de peau évalués. Notamment, les véhicules électriques non chargés d'ARNm de COL1A1 ont également pu obtenir une diminution modeste du nombre de rides, ce qui est cohérent avec les études concluant que les véhicules électriques "vides" de certaines cellules parentales sont des candidats thérapeutiques potentiels en raison de cargaisons endogènes (pourtant, les mécanismes détaillés sous-jacents de tels phénomènes doivent être explorés plus avant)36.

Par rapport à l'expression relativement durable des thérapies géniques basées sur l'ADN, les thérapies par ARNm peuvent aider à faire progresser la thérapie génique et à réduire les risques d'événements indésirables en raison de la rétention des ARNm dans le cytoplasme, sans pénétration dans le noyau48,49. Par conséquent, les modalités basées sur l'ARNm présentent des avantages par rapport aux thérapies géniques basées sur l'ADN et les virus, telles que la capacité de contourner le processus de transcription traditionnel et l'absence de risque d'intégration génomique (par opposition à l'utilisation de certains vecteurs viraux adéno-associés, traditionnellement considéré comme ayant un profil de risque faible50). Cependant, la traduction clinique de l'ARNm thérapeutique est encore limitée. Pour les produits d'ARNm développés à l'aide de LNP, l'immunogénicité des composants de PEGylation à la surface des LNP ainsi que certaines formulations de support ont été liées à l'inflammation et à de nombreux événements indésirables liés à la sécurité51,52. En effet, lorsque nous avons comparé la délivrance des COL1A1-LNP et des COL1A1-EV in vivo, nous avons constaté que les COL1A1-LNP étaient capables de produire des protéines de collagène et de réduire les rides dermiques, mais provoquaient également un infiltrat inflammatoire notable dans les tissus locaux, alors que les COL1A1-EV le faisaient. pas. Plusieurs études récentes ont montré que les véhicules électriques sont caractérisés par de faibles niveaux d'immunogénicité, certains rapports précliniques et essais cliniques (clinicaltrials.gov : NCT05191381, NCT05216562) suggérant que les véhicules électriques dérivés de divers types de cellules ont des effets immunosuppresseurs, bien qu'il convient de noter que ces études utilisaient principalement des cellules stromales mésenchymateuses et des cellules dendritiques comme types de cellules donneuses36,53,54.

Les futurs défis pour l'application clinique de COL1A1-EV MN incluent l'optimisation de la géométrie des micro-aiguilles avec des véhicules électriques plus densément protégés ainsi que des conditions de stockage optimisées, car l'ARNm est soumis à une dégradation rapide lorsqu'il n'est pas conservé à -80 ° C ou en dessous55. Idéalement, les futurs systèmes EV peuvent être emballés sous forme d'aliquotes prêtes à l'emploi et expédiés à des températures appropriées, ce qui améliorerait considérablement la praticabilité des systèmes COL1A1-EV MN pour une utilisation clinique. Nous visons également à étendre les applications thérapeutiques dans notre système pour inclure des éléments tels que COL7 pour les maladies génétiques orphelines telles que l'épidermolyse bulleuse56. Nous n'avons livré que de l'ARNm via le système de micro-aiguilles, mais le système convient également pour emballer d'autres types de cargaisons EV, telles que les miARN et les siARN, et d'autres agents thérapeutiques bioactifs tels que les peptides et les protéines57,58,59. Bien que de nombreux défis doivent être surmontés avant que le système d'administration de VE à base de micro-aiguilles puisse être essayé chez l'homme, en raison de l'amélioration de la biocompatibilité et du profil d'effets secondaires bénins des VE par rapport aux LNP et au virus adéno-associé (AAV), nous croient que le système pourrait constituer un support universel d'acide nucléique pour le traitement d'une gamme de maladies et d'affections humaines.

Les nHDF (PCS-201-010) ont été achetés auprès de l'ATCC et cultivés dans un milieu DMEM (Thermo Fisher) contenant 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS ; 10099141C, Thermo Fisher) à 37 °C dans des conditions humidifiées équilibrées avec 5 % de CO2 .

Pour le CNP, une seule couche de nHDF a été ensemencée sur une surface de CNP 3D de 1 cm × 1 cm pour une incubation d'une nuit comme décrit précédemment. Le plasmide d'ADNc COL1A1 humain (NM_000088.3) avec étiquette GFP a été acheté auprès de Sino Biological (HG11776-ACG). Des plasmides préchargés dans du tampon PBS ont été injectés dans des cellules individuelles via des nanocanaux en utilisant une intensité de champ électrique de 250 V cm-1 avec 10 impulsions à 10 ms par impulsion, avec un intervalle de 0,1 s. Diverses conditions d'électroporation ont été testées pour déterminer les conditions optimales. Le BEP (gene pulser xcell, Bio-rad) a été réalisé en utilisant une intensité de champ électrique de 1 250 V cm-1 avec 1 impulsion de 20 ms. Les plasmides pCMV-COL1A1-GFP ont été préparés à une concentration de 500 ng ml-1 dans du PBS pour la transfection.

Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM contenant du sérum. Le milieu de culture cellulaire contenant du sérum a été éliminé lors de la réalisation de CNP. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS 3 fois et cultivées dans un milieu de culture cellulaire sans sérum pendant 24 h après CNP. Les véhicules électriques ont été collectés à partir de surnageants de culture cellulaire. En bref, le milieu de culture cellulaire (CCM) a été centrifugé à 200 × g pendant 5 min pour éliminer les cellules et les débris, après quoi il a été centrifugé à nouveau à 2 000 × g pendant 30 min. Une unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-4 (10 kDa, Millipore, 801024) a été utilisée pour concentrer le CCM. L'échantillon EV a été purifié à l'aide d'un réactif d'isolement d'exosome total (Invitrogen, 4478360). La taille et le nombre de particules EV ont été mesurés à l'aide de NanoSight NS300 (Malvern). Le rendement en ARN et la distribution de taille ont été analysés à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 avec un kit RNA 6000 Pico (Agilent Technologies).

L'expression de l'ARNm COL1A1 humain dans les véhicules électriques a été mesurée par RT-qPCR selon le protocole recommandé par le fabricant. En bref, l'ARN total des véhicules électriques purifiés a été obtenu à l'aide d'un mini kit de purification d'ARN (Norgen Biotek, 55000) et d'un kit d'élimination d'ADN (Norgen Biotek, 25720). Un système de synthèse du premier brin SuperScript III (Invitrogen) a été utilisé pour synthétiser l'ADN complémentaire du premier brin, avec des hexamères aléatoires comme amorces. L'expression des gènes a été mesurée à l'aide du TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820). Les séquences d'amorces utilisées étaient les suivantes : COL1A1 (humain), sens : 5'-CCTGGAAAGAATGGAGATGA-3' et sens inverse : 5'-ACCATCCAAACCACTGAAAC-3' ; Gapdh (humain), avant : 5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA - 3′ et inverse : 5′ - AGAGGCAGGGATGATGTTCT - 3′ (tableau supplémentaire 1).

Des souris femelles nues (âgées de 10 à 12 semaines) ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et la région de la peau dorsale a été injectée avec 50 μl 2, 7 × 109 nombre de copies d'EV d'ARNm CNP COL1A1. À des moments prédéfinis (12, 24, 48, 96 h, 7 j, 10 j, 14 j) suivant l'injection cutanée, la peau a été excisée et placée dans du formaldéhyde à 4 % pour fixation. Par la suite, les tranches ont été incluses dans de la paraffine puis sectionnées en tranches de 4 μm. Le test d'hybridation in situ automatisé RNAscope pour la détection de l'ARNm COL1A1 humain a été réalisé à l'aide du système d'hybridation HybEZ II (Advanced Cell Diagnostics (ACD)), et tous les réactifs d'hybridation in situ étaient des produits ACD. En bref, la récupération de la cible a été effectuée à 95 ° C pendant 15 min à l'aide du tampon de récupération d'épitope Leica 2, suivie d'un traitement à la protéase à 42 ° C pendant 15 min. La sonde (RNAscope Probe-Hs-COL1A1, 401891, ACD) a été hybridée pendant 2 h à 40 °C, suivie d'une amplification RNAscope, et le kit RNAscope 2.5 HD Assay BROWN a été utilisé pour la visualisation de la coloration. La sonde RNAscope 2.5 LS-Rn-Ppib a été utilisée comme contrôle négatif.

Les coupes de tissus ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min à température ambiante et lavées 3 fois avec du PBS (Vetec) pendant 5 min chacune. Ensuite, le tissu a été transféré dans du Triton X-100 à 0, 2% pendant 15 min (perméabilisé), suivi d'un blocage avec du BSA pendant 40 min et de l'ajout d'anticorps primaires (ab34710 et ab6556, Abcam) pour un blocage pendant la nuit à 4 ° C. Enfin, l'anticorps secondaire (ab6939 et ab6717, Abcam) a été ajouté et les coupes de tissus placées à température ambiante pendant 60 min. Les coupes de tissus ont ensuite été lavées avec du PBS, additionnées de DAPI (ThermoFisher) pour la coloration nucléaire, puis montées pour observation.

Les coupes de tissus ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min, lavées 3 fois avec du PBS (pH 7,4) pendant 5 min chacune, puis transférées dans une boîte de récupération contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (pH 9,0) solution de récupération d'antigène pour la récupération d'antigène dans un four micro-onde. Ensuite, les coupes ont été incubées dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % à température ambiante pendant 25 min dans l'obscurité. Après lavage avec du PBS, le tissu a été uniformément recouvert de 3 % de BSA ou de 10 % de sérum de lapin normal, bloqué à température ambiante pendant 30 min, additionné d'anticorps primaires (ab34710 et ab6556, Abcam) et incubé pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, un anticorps secondaire (marqué HRP) correspondant à l'anticorps primaire a été ajouté pour recouvrir les coupes de tissu, qui ont ensuite été incubées à température ambiante pendant 50 min. Pour le développement de la couleur de la 3,3'-diaminobenzidine (DAB), les lames ont été placées dans du PBS (pH 7,4) et lavées 3 fois sous agitation sur un agitateur de décoloration pendant 5 min à chaque fois. Après que les tranches ont été légèrement séchées, la solution de développement de couleur DAB fraîchement préparée a été ajoutée goutte à goutte dans le cercle. Le temps de développement a été contrôlé au microscope. De l'hématoxyline, une solution de différenciation d'hématoxyline et une solution de retour de bleu d'hématoxyline ont été ajoutées séquentiellement pour la contre-coloration des noyaux. Enfin, les lames de verre ont été placées dans de l'éthanol anhydre et du xylène pour déshydratation et scellement.

Le travail sur les animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Laboratoire de la baie de Shenzhen (n° D2021-107) ou des laboratoires partenaires. Pour créer le modèle de photovieillissement de la peau, des souris nude femelles (âgées de 10 à 12 semaines) ont été soumises à une irradiation UVB de la peau dorsale tous les deux jours pendant 8 semaines comme suit : les souris ont été anesthésiées avec 1,5 % d'isoflurane, puis une irradiation UV a été délivrée avec une lampe UV (Philips ; spectre d'émission 311 nm) positionnée à 30 cm au-dessus de la peau dorsale des souris tous les deux jours pendant 8 semaines. L'intensité de l'irradiation UV, représentée par la dose érythémale minimale (MED), a été fixée à 1 MED pendant les 2 premières semaines (60 mJ cm-2), élevée à 2 MED (120 mJ cm-2) la troisième semaine, 3 MED (180 mJ cm-2) au cours de la quatrième semaine et 4 MED (240 mJ cm-2) au cours des cinquième à huitième semaines de l'expérience. Le volume UVB total irradié était d'environ 80 MED. Pour le traitement à base de seringue de la peau photovieillie, des souris nude, après la période d'irradiation de 8 semaines décrite ci-dessus, ont été assignées à 1 des 6 groupes de traitement (4 souris chacun) : (1) irradiation UVB + solution saline, (2) irradiation UVB + Acide rétinoïque à 0,05 %, (3) irradiation UVB + nHDF-EV non chargées livrées avec une seringue Hamilton 32G, (4) irradiation UVB + 2,7 × 109 nombre de copies COL1A1 ARNm COL1A1-LNP, (5) irradiation UVB + 2,7 × 109 nombre de copies COL1A1 ARNm COL1A1- EV livrés avec une seringue Hamilton 32G et (6) aucune exposition aux UVB (simulacre). Les traitements cutanés ont eu lieu les jours 0, 4, 7, 14 et 21. L'ensemble de la peau du dos a été divisé en trois parties pour analyse.

Une réplique en silicone SILFLO et un localisateur d'anneaux ont été achetés auprès de Clinical & Derm. Des répliques de la peau du dos (dorsale) des souris ont été obtenues à la fin de la période de traitement. Les répliques ont été analysées par stéréomicroscopie (Olympus SZX7) et les images correspondantes ont été analysées par ImageJ (NIH).

La fabrication du patch à micro-aiguilles a été réalisée à l'aide d'un micro-moule en silicone, chaque cavité d'aiguille mesurant 400 μm dans un diamètre de base rond et 1 000 μm de hauteur. Ces cavités d'aiguille ont été disposées dans un réseau 10 × 10 avec un espacement de pointe à pointe de 700 μm. Pour la préparation du patch microneedle, 150 μl de solution HA à 15% en poids ont été mélangés avec 50 μl de VE, maintenus sous vide pendant 30 min puis transférés à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient déposés dans la cavité de l'aiguille. Enfin, 1 ml de solution de HA à 15 % en poids a été chargé sur le micromoule et le micromoule placé dans un coffre de séchage avec un ventilateur attaché pour accélérer le processus d'évaporation pour la solidification. Après solidification, le patch à micro-aiguilles a été détaché du moule en silicone pour une utilisation ultérieure. Pour évaluer l'administration de COL1A1-EV via les patchs de micro-aiguilles personnalisés, des souris nude ont été irradiées pendant 8 semaines comme décrit ci-dessus et assignées à 1 des 5 groupes de traitement (4 souris chacun) : (1) irradiation UVB + solution saline, (2) irradiation UVB + 22 × 109 nombre de copies COL1A1 ARNm COL1A1-EV délivrés par une seringue Hamilton 28G, (3) irradiation UVB + patch de micro-aiguille HA, (4) irradiation UVB + 1010 nHDF-EV déchargés délivrés via une micro-aiguille (micro-aiguille EV déchargée) et (5) UVB irradiation + micro-aiguille HA à 15 % mélangée à 22 × 109 numéro de copie COL1A1 ARNm COL1A1-EV.

Les souris traitées à la micro-aiguille ont été imagées avec un système d'imagerie in vivo (IVIS Spectrum, Perkin Elmer) aux jours 1, 2, 4, 7, 10 et 14. Les paramètres ont été définis comme suit : temps d'exposition 15 s, excitation 570 nm, émission 680 nm, 2F/stop et champ de vision de 13,6 cm dans les temps d'imagerie de fluorescence spécifiés. L'analyse quantitative de l'intensité de fluorescence RFP a été réalisée en mesurant l'efficacité moyenne du rayonnement (photon s-1 cm-2 sr-1 µW-1) dans une région d'intérêt. Les données ont été normalisées à l'intensité de fluorescence au jour 1.

Les données quantitatives sont représentées par la moyenne ± sem. Aucune donnée n'a été exclue de cette étude. Pour analyser la différence statistique entre deux groupes, des tests t de Student bilatéraux ont été utilisés pour les comparaisons. Pour deux groupes ou plus, une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisée pour analyser la différence statistique. L'ANOVA bidirectionnelle a été choisie pour analyser la différence statistique entre les points de données des groupes. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. GraphPad Prism 8.3 a été utilisé pour l'analyse des données.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les principales données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Les données sources des chiffres sont disponibles sur figshare à l'adresse https://figshare.com/articles/dataset/SD_FIGS_xlsx/21514641. Les ensembles de données brutes et analysées générées au cours de l'étude sont disponibles à des fins de recherche auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Sahin, U., Kariko, K. & Tureci, O. Thérapeutique à base d'ARNm - développement d'une nouvelle classe de médicaments. Nat. Rev. Drug Discov. 13, 759–780 (2014).

Article CAS Google Scholar

Muik, A. et al. Neutralisation du SRAS-CoV-2 Omicron par les sérums humains induits par le vaccin à ARNm BNT162b2. Sciences 375, 678-680 (2022).

Article CAS Google Scholar

Kowalski, PS, Rudra, A., Miao, L. & Anderson, DG Livrer le messager : avancées dans les technologies pour la livraison d'ARNm thérapeutique. Mol. Là. 27, 710–728 (2019).

Article CAS Google Scholar

Wang, C., Zhang, Y. & Dong, Y. Formulations d'ARNm de nanoparticules lipidiques pour des applications thérapeutiques. Acc. Chim. Rés. 54, 4283–4293 (2021).

Article CAS Google Scholar

Qiu, M., Li, Y., Bloomer, H. & Xu, Q. Développement de nanoparticules lipidiques biodégradables pour la délivrance intracellulaire d'ARNm et l'édition du génome. Acc. Chim. Rés. 54, 4001–4011 (2021).

Article CAS Google Scholar

Lokugamage, MP et al. Une activation immunitaire innée légère annule la délivrance efficace d'ARN médiée par les nanoparticules. Adv. Mater. 32, e1904905 (2020).

Article Google Scholar

Szebeni, J. et al. Appliquer les leçons tirées des nanomédecines pour comprendre les réactions d'hypersensibilité rares aux vaccins SARS-CoV-2 à base d'ARNm. Nat. Nanotechnologie. 17, 337–346 (2022).

Article CAS Google Scholar

Moghimi, SM Réactions allergiques et anaphylaxie aux vaccins COVID-19 à base de LNP. Mol. Là. 29, 898–900 (2021).

Article CAS Google Scholar

Valadi, H. et al. Le transfert d'ARNm et de microARN par l'exosome est un nouveau mécanisme d'échange génétique entre cellules. Nat. Cell Biol. 9, 654–659 (2007).

Article CAS Google Scholar

Cheng, L. & Hill, AF Exploitation thérapeutique des vésicules extracellulaires. Nat. Rev. Drug Discov. 21, 379–399 (2022).

Article CAS Google Scholar

de Jong, OG et al. Administration de médicaments avec des vésicules extracellulaires : de l'imagination à l'innovation. Acc. Chim. Rés. 52, 1761-1770 (2019).

Article Google Scholar

Herrmann, IK, Wood, MJA et Fuhrmann, G. Vésicules extracellulaires en tant que plate-forme d'administration de médicaments de nouvelle génération. Nat. Nanotechnologie. 16, 748–759 (2021).

Article CAS Google Scholar

van Niel, G., D'Angelo, G. & Raposo, G. Faire la lumière sur la biologie cellulaire des vésicules extracellulaires. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).

Article Google Scholar

Yang, Z. et al. Génération à grande échelle d'exosomes fonctionnels encapsulant l'ARNm via la nanoporation cellulaire. Nat. Biomédical. Ing. 4, 69–83 (2020).

Article CAS Google Scholar

Sharma, MR, Werth, B. & Werth, VP Modèles animaux de photodommages aigus : comparaisons des réponses anatomiques, cellulaires et moléculaires chez les souris C57BL/6J, SKH1 et Balb/c. Photochem. Photobiol. 87, 690–698 (2011).

Article CAS Google Scholar

Varani, J. et al. Diminution de la production de collagène dans une peau vieillie chronologiquement : rôles de l'altération dépendante de l'âge dans la fonction des fibroblastes et de la stimulation mécanique défectueuse. Suis. J. Pathol. 168, 1861-1868 (2006).

Article CAS Google Scholar

Fisher, GJWZ Pathophysiologie du vieillissement prématuré de la peau induit par la lumière ultraviolette. N. Engl. J. Med. 337, 1419–1428 (1997).

Article CAS Google Scholar

Buranasudja, V., Rani, D., Malla, A., Kobtrakul, K. et Vimolmangkang, S. Aperçu des activités antioxydantes et du potentiel anti-vieillissement de la peau de l'extrait de cal de Centella asiatica (L.). Sci. Rep. 11, 13459 (2021).

Article CAS Google Scholar

Wada, N., Sakamoto, T. & Matsugo, S. Acides aminés de type mycosporine et leurs dérivés en tant qu'antioxydants naturels. Antioxydants 4, 603–646 (2015).

Article CAS Google Scholar

Xiong, ZM et al. Potentiels de protection contre les rayonnements ultraviolets du bleu de méthylène pour la peau humaine et la santé des récifs coralliens. Sci. Rep. 11, 10871 (2021).

Article CAS Google Scholar

Bielli, A. et al. Expression de la protéine II de liaison à l'acide rétinoïque cellulaire et son rôle potentiel dans le vieillissement cutané. 11 ans, 1619-1632 (2019).

Article CAS Google Scholar

Song, H., Zhang, S., Zhang, L. & Li, B. Effet des peptides de collagène administrés par voie orale à partir d'os de bovin sur le vieillissement cutané chez des souris d'âge chronologique. Nutriments 9, 1209 (2017).

Article Google Scholar

Jeong, S. et al. Avantages anti-rides du complexe de peptides stimulant l'expression des protéines de la membrane basale de la peau. Int. J. Mol. Sci. 21, 73 (2019).

Article Google Scholar

Lee, AY Anomalies de la pigmentation cutanée et leur possible relation avec le vieillissement cutané. Int. J. Mol. Sci. 22, 3727 (2021).

Article CAS Google Scholar

Kim, JH et al. Évaluation comparative de l'efficacité du nouveau produit de comblement dermique complexe acide hyaluronique-polynucléotide. Sci. Rep. 10, 5127 (2020).

Article CAS Google Scholar

Urdiales-Galvez, F., Martin-Sanchez, M., Maiz-Jimenez, M., Castellano-Miralla, A. & Lionetti-Leone, L. Utilisation concomitante d'acide hyaluronique et de laser dans le rajeunissement du visage. Plastique esthétique. Surg. 43, 1061-1070 (2019).

Article Google Scholar

Fisher, GJ, Varani, J. & Voorhees, JJ Regarder plus vieux : effondrement des fibroblastes et implications thérapeutiques. Cambre. Dermatol. 144, 666–672 (2008).

Article Google Scholar

Quan, T. et al. L'amélioration du support structurel du microenvironnement dermique active les fibroblastes, les cellules endothéliales et les kératinocytes dans la peau humaine âgée in vivo. J. Invest. Dermatol. 133, 658–667 (2013).

Article CAS Google Scholar

Shakouri, R. et al. Étude in vivo des effets d'un appareil portable à plasma froid et de la vitamine C pour le rajeunissement de la peau. Sci. Rép. 11, 21915 (2021).

Article CAS Google Scholar

de Araujo, R., Lobo, M., Trindade, K., Silva, DF et Pereira, N. Facteurs de croissance des fibroblastes : un mécanisme de contrôle du vieillissement cutané. Peau Pharmacol. Physiol. 32, 275-282 (2019).

Article Google Scholar

Cole, MA, Quan, T., Voorhees, JJ & Fisher, GJ Régulation de la matrice extracellulaire de la fonction des fibroblastes : redéfinir notre perspective sur le vieillissement cutané. J. Cellule Commun. Signal. 12, 35–43 (2018).

Article Google Scholar

Shi, J. et al. Un examen de la livraison intracellulaire basée sur l'électroporation. Molécules 23, 3044 (2018).

Article Google Scholar

Todorova, K. & Mandinova, A. Nouvelles approches pour la gestion de la peau âgée et du cancer de la peau non mélanique. Adv. Déliv. Rév.153, 18–27 (2020).

Article CAS Google Scholar

Choi, JS et al. Récupération fonctionnelle dans les fibroblastes dermiques humains photo-endommagés par des vésicules extracellulaires de cellules souches dérivées de l'adiposité humaine. J. Extracell. Vésicules 8, 1565885 (2019).

Article CAS Google Scholar

Alpermann, H. & Vogel, HG Effet d'une irradiation ultraviolette répétée sur la peau de souris sans poils. Cambre. Dermatol. Rés. 262, 15–25 (1978).

Article CAS Google Scholar

Hu, S. et al. L'injection sans aiguille d'exosomes dérivés de sphéroïdes de fibroblastes dermiques humains améliore le photovieillissement cutané. ACS Nano 13, 11273–11282 (2019).

Article CAS Google Scholar

Kim, JD, Kim, M., Yang, H., Lee, K. & Jung, H. Soufflage d'air par gouttelettes : nouvelle fabrication de micro-aiguilles à dissolution. J. Contrôle. Communiqué 170, 430–436 (2013).

Article CAS Google Scholar

Abd, E. et al. Modèles de peau pour le test de médicaments transdermiques. Clin. Pharmacol. 8, 163–176 (2016).

CAS Google Scholar

Zheng, T. et al. Les exosomes plasmatiques se propagent et se regroupent autour des plaques β-amyloïdes dans un modèle animal de la maladie d'Alzheimer. Devant. Neurosciences vieillissantes. 9, 12 (2017).

Article Google Scholar

Li, Z. et al. Thérapie génique Ldlr basée sur les exosomes pour l'hypercholestérolémie familiale dans un modèle murin. Théranostic 11, 2953-2965 (2021).

Article CAS Google Scholar

Cao, H. et al. Imagerie en temps réel in vivo des vésicules extracellulaires dans la régénération du foie via des luminogènes d'émission induits par l'agrégation. ACS Nano 13, 3522–3533 (2019).

Article CAS Google Scholar

Kamerkar, S. et al. Les exosomes facilitent le ciblage thérapeutique des KRAS oncogènes dans le cancer du pancréas. Nature 546, 498–503 (2017).

Article CAS Google Scholar

O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, LC & Breakefield, XO Livraison d'ARN par des vésicules extracellulaires dans des cellules de mammifères et ses applications. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 21, 585–606 (2020).

Article Google Scholar

Yin, H. et al. Vecteurs non viraux pour la thérapie génique. Nat. Révérend Genet. 15, 541-555 (2014).

Article CAS Google Scholar

Zhang, Z. et al. COL1A1 : une cible thérapeutique potentielle du cancer colorectal exprimant KRAS sauvage ou mutant. Int. J. Oncol. 53, 1869-1880 (2018).

CAS Google Scholar

Yu, J. et al. Les patchs à micro-aiguilles chargés de vésicules sensibles à l'hypoxie fournissent une administration rapide d'insuline sensible au glucose. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 112, 8260–8265 (2015).

Article CAS Google Scholar

Wu, T. et al. Cadres organiques métalliques de cyclodextrine biomimétique à médiation par micro-aiguilles pour le ciblage actif et le traitement des cicatrices hypertrophiques. ACS Nano 15, 20087–20104 (2021).

Article CAS Google Scholar

Paunovska, K., Loughrey, D. & Dahlman, JE Systèmes d'administration de médicaments pour les thérapies à base d'ARN. Nat. Révérend Genet. 23, 265-280 (2022).

van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, OJ, Murthy, N. & Schaffer, DV Le défi de la livraison : tenir la promesse de l'édition thérapeutique du génome. Nat. Biotechnol. 38, 845–855 (2020).

Article Google Scholar

Mullard, A. La communauté de la thérapie génique est aux prises avec des problèmes de toxicité, à mesure que le pipeline arrive à maturité. Nat. Rev. Drug Discov. 20, 804–805 (2021).

Article CAS Google Scholar

Shi, D. et al. Pégyler ou ne pas pégyler : propriétés immunologiques du composant le plus populaire de la nanomédecine, le polyéthylène glycol et ses alternatives. Adv. Déliv. Rev.180, 114079 (2022).

Article CAS Google Scholar

Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D. & Schubert, US Poly(éthylène glycol) dans l'administration de médicaments : avantages et inconvénients ainsi que des alternatives potentielles. Angew. Chim. Int. Éd. angl. 49, 6288–6308 (2010).

Article CAS Google Scholar

Qian, X. et al. Effets immunosuppresseurs des exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses. Stem Cell Rev. Rep. 17, 411–427 (2021).

Article CAS Google Scholar

Kim, SH et al. Les exosomes dérivés de cellules dendritiques traitées à l'IL-10 peuvent supprimer l'inflammation et l'arthrite induite par le collagène. J. Immunol. 174, 6440–6448 (2005).

Article CAS Google Scholar

Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, KA vaccins à ARNm pour les maladies infectieuses : principes, administration et traduction clinique. Nat. Rev. Drug Discov. 20, 817–838 (2021).

Article CAS Google Scholar

Peking, P., Koller, U. & Murauer, EM Thérapies fonctionnelles pour la réparation des plaies cutanées dans l'épidermolyse bulleuse. Adv. L'administration de médicaments. tour. 129, 330–343 (2018).

Article CAS Google Scholar

Vader, P., Mol, EA, Pasterkamp, ​​G. & Schiffelers, RM Vésicules extracellulaires pour l'administration de médicaments. Adv. Déliv. Rév. 106, 148-156 (2016).

Article CAS Google Scholar

Born, LJ, Harmon, JW & Jay, SM Potentiel thérapeutique de l'ARN long non codant associé aux vésicules extracellulaires. Bioeng. Trad. Méd. 5, e10172 (2020).

Article CAS Google Scholar

Pi, F. et al. Orientation des nanoparticules pour contrôler la charge d'ARN et l'affichage des ligands sur les vésicules extracellulaires pour la régression du cancer. Nat. Nanotechnologie. 13, 82–89 (2018).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions C. Wogan de la Division de radio-oncologie, MD Anderson Cancer Center, pour son aide éditoriale.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yi You, Yu Tian et Zhaogang Yang.

École supérieure de Shenzhen de l'Université de Pékin, Shenzhen, Chine

Yi You, Yu Tian, ​​​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu et Andrew S. Lee

Institut de recherche sur le cancer, Laboratoire de la baie de Shenzhen, Shenzhen, Chine

Yi You, Yu Tian, ​​​​Yuhao Tong, Andreanne Poppy Estania, Jianhong Cao, Wei-Hsiang Hsu, Yutong Liu et Andrew S. Lee

Département de radio-oncologie, Université du Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, États-Unis

Zhaogang Yang, Benjamin R. Schrank, JongHoon Ha, Shiyan Dong, Xuefeng Li, Yifan Wang et Wen Jiang

École des sciences de la vie, Université de Jilin, Changchun, Chine

Zhaogang Yang, Ziwei Li, Yarong Zhao, Huan Zhang et Lesheng Teng

Spot Biosystems Ltd., Palo Alto, Californie, États-Unis

Junfeng Shi, Kwang Joo Kwak et Ly James Lee

Département de génie chimique et biomoléculaire, Université d'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis

Chi-Ling Chiang

Département de neurochirurgie, Université du Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, États-Unis

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup et Betty YS Kim

Le sixième hôpital affilié de l'Université médicale de Guangzhou, l'hôpital populaire de Qingyuan ; State Key Laboratory of Respiratory Disease, Sino-French Hoffmann Institute, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Chine

Xuefeng Li

Hôpital Fuwai Académie chinoise des sciences médicales de Shenzhen, Laboratoire clé des maladies cardiovasculaires de Shenzhen, Laboratoire clé d'État des maladies cardiovasculaires et Collège médical de l'Union de Pékin, Shenzhen, Chine

Wen-Jing Lu et Feng Lan

Laboratoire de médecine de précision cardiovasculaire de Pékin, Laboratoire clé de génie biomédical pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires, Laboratoire clé des maladies cardiovasculaires liées au remodelage, Ministère de l'éducation, Hôpital Anzhen de Pékin, Université médicale de la capitale, Pékin, Chine

Wen Jing Lu

Département de dermatologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, États-Unis

Eman Bahrani

Brain Tumor Center, Université du Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, États-Unis

Kristin Huntoon, DaeYong Lee, Thomas D. Gallup et Betty YS Kim

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

ASL et FL ont conçu l'œuvre ; ASL, WJ, FL, ZY et BYSK ont supervisé la recherche ; ASL, JS, LJL et KJK ont développé la technologie ; ASL, YY, YT, FL, WJ, ZY, LT et BYSK ont conçu les expériences ; ASL, LJL, ZY, YT, YY, WJ, FL, BYSK, KJK, JS, BS, KH, DL, TG, LT, W.-JL et EB ont fourni une contribution intellectuelle ; ASL, LJL, ZY, WJ, JS, SD, EB et BYSK ont rédigé le manuscrit, avec la contribution de tous les auteurs ; YY, YT, JS, KJK, YT, APE, JC, C.-LC, W.-HHYL, ZL, YZ, HZ, XL, YW et JH ont mené des expériences ; YY, YT, ZY et APE ont préparé des figures et des vidéos.

Correspondance à Feng Lan, Betty YS Kim ou Andrew S. Lee.

ASL et LJL sont consultants et actionnaires de Spot Biosystems, Ltd. JS et KJK sont des employés de Spot Biosystems, Ltd.

Nature Biomedical Engineering remercie Sun Hwa Kim, Chuanbin Wu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Images de fluorescence de nHDF affamés de sérum traités avec des EV COL1A1-GFP et des protéines traduites à partir de l'ARNm COL1A1-GFP délivré après 48 h. Barre d'échelle, 100 µm. b, Intensité de fluorescence des cellules traitées avec COL1A1-EVs (n = 3 pour tous les groupes, *** P < 0,001 Contrôle vs COL1A1-EVs) en 48 h. c, RT-qPCR montre des niveaux de transcription d'ARNm de collagène plus élevés après l'administration in vitro d'ARNm de COL1A1 à partir d'EV (n = 3 pour tous les groupes, *** P < 0,001 Contrôle vs COL1A1-EV) en 48 h. d, Western blots montrent une protéine COL1A1 élevée dans les fibroblastes traités (n = 3 pour tous les groupes, ** P = 0,001 Contrôle vs COL1A1-EVs).e, Pro-collagène I recueilli à partir du surnageant et détecté par ELISA (n = 3 pour tous groupes, ***P < 0,001 Contrôle vs COL1A1-EVs) en 48 h. Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM ; Des tests t de Student bilatéraux ont été utilisés pour les comparaisons en (b–e).

a, Observations microscopiques de la peau dorsale et des répliques de peau. Barre d'échelle, 5 mm. b, Profondeur moyenne des rides dans les répliques cutanées (n = 4 pour tous les groupes, ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline ; **P = 0,0025 COL1A1-LNPs vs Saline ; +++P < 0,001 COL1A1-EVs vs COL1A1 -LNP). c, Longueur moyenne des rides analysée sur des répliques de peau (n = 4 pour tous les groupes, #P = 0,0203 EVs non chargés vs Saline ; *P = 0,0405 COL1A1-LNPs vs Saline ; ※※※P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline ; ++ P = 0,0015 COL1A1-EVs vs COL1A1-LNPs). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisée pour les comparaisons en (b, c). NS, non significatif.

a, des échantillons de peau de souris ayant reçu une injection unique d'ARNm COL1A1 numéro de copie 22E9 dans des COL1A1-EV et des COL1A1-LNP ont été récoltés après 24 h. Des échantillons de peau de souris ont été analysés par cytométrie en flux, pour b, pourcentage de cellules leucocytaires, et c, pourcentage de neutrophiles (n = 3 pour tous les groupes, ** P = 0,0034 COL1A1-LNPs vs sham pour % CD45 + cellules ; *** P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Sham pour le % de neutrophiles parmi les cellules CD45+ ; NS, non significatif). d, La quantification des protéines via ELISA pour IFN-γ, IL-1β, IL-6 et TNF-α montre une élévation des cytokines inflammatoires dans le groupe COL1A1-LNP par rapport aux COL1A1-EV (n = 3 pour tous les groupes, ** P = 0,0074 COL1A1-LNPs vs Sham pour IFN-γ ; #P = 0,0333 COL1A1-EVs vs Sham et ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Sham pour IL-1β ; ***P < 0,001 COL1A1-LNPs vs Sham pour IL-6 ; *P = 0,0146 COL1A1-LNPs vs Sham pour TNF-α ; NS, non significatif). e, Images d'immunocoloration représentatives pour TNF-α et (f) IL-6 après injection de COL1A1-EV et COL1A1-LNP. Barre d'échelle, 100 µm. Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons en (b–d).

a, les rides ont été suivies les jours 0, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 et 56 jours après les traitements indiqués (5 injections à faible dose de COL1A1-EV (2.7E9 numéro de copie COL1A1 ARNm) , COL1A1-LNPs (2.7E9 numéro de copie COL1A1 ARNm), EVs déchargés, 0,05% acide rétinoïque [RA], solution saline). n = 4, barre d'échelle, 5 mm. Les souris nues femelles qui n'ont pas été exposées aux UV constituaient le groupe fictif. b, Nombre de rides sur la peau dorsale des souris au fil du temps. (n = 4 pour tous les groupes ; **P = 0,008 COL1A1-EVs vs Saline au jour 7 ; **P = 0,004 COL1A1-EVs vs Saline au jour 21, **P = 0,001 COL1A1-EVs vs Saline au jour 35 ; ***P < 0,001 EV-COL1A1 contre solution saline aux jours 14, 28, 42 et 49                0,025 AR contre solution saline au jour 21 ; ††P = 0,007 AR contre solution saline au jour 28 ; ##P = 0,0071 EV déchargés vs Saline au jour 14 ; ##P = 0,004 EV déchargés vs Saline au jour 21 ; ##P = 0,002 EV déchargés vs Saline au jour 28 ; #P = 0,015 EV déchargés vs Saline au jour 35 ; ※※P = 0,0053 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 14  ; ※※P = 0,0041 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 21 ; ※P = 0,017 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 28 ; ※P = 0,022 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 35) . c, Surface totale des rides (n = 4 pour tous les groupes, *P = 0,012 COL1A1-EVs vs Saline au jour 7 ; ***P < 0,001 COL1A1-EVs vs Saline aux jours 14, 21, 28 et 35 ; *P = 0,015 COL1A1-EVs vs solution saline au jour 42   ; ††P = 0,008 RA vs solution saline au jour 14 ; ††P = 0,007 RA vs solution saline aux jours 21 et 35 ;††P = 0,005 RA vs solution saline au jour 28 ; #P = 0,012 EV déchargés par rapport à la solution saline au jour 14 ; #P = 0,035 EV déchargés par rapport à la solution saline au jour 21 ; ##P = 0,002 EV déchargés par rapport à la solution saline au jour 28 ; ※P = 0,062 COL1A1-LNP par rapport à la solution saline au jour 14 ; ※P = 0,039 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 21 ; ※※P = 0,0027 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 28 ; ※※P = 0,046 COL1A1-LNPs vs Saline au jour 35). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en (b, c).

a–c, observation microscopique de la peau dorsale et de la réplique cutanée à 1 mois, 2 mois et 3 mois après le traitement. Barre d'échelle, 5 mm. d, e Quantification de la longueur moyenne des rides (n = 4 pour tous les groupes, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs Saline à 1 mois et 2 mois ; ###P < 0,001 Injection à l'aiguille vs Saline à 1 mois ; † †P = 0,031 HA MN vs Saline à 1 mois ;※※P = 0,029 EV MN sans charge vs Saline à 1 mois) et profondeur moyenne des rides (n = 4 pour tous les groupes, ***P < 0,001 COL1A1-EV MN vs Saline à 1 mois ; **P = 0,001 COL1A1-EV MN vs solution saline à 2 mois ; injection à l'aiguille vs solution saline non significative à 1 mois ; HA MN vs solution saline non significative à 1 mois) à partir de répliques de peau. Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en (d, e).

a, Après 8 semaines de photovieillissement irradié aux UV, les rides ont été suivies pour les souris traitées tous les 30 jours avec 1) solution saline, 2) COL1A1-EV et 3) COL1A1-EV MN les jours 0, 4, 7, 14, 21, 28 , 49, 70 et 91 (COL1A1-EV, COL1A1-EV MN, solution saline). n = 4, barre d'échelle, 5 mm. b, Nombre total de rides (n = 4 pour tous les groupes ; *P = 0,019 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 4 ; #P = 0,034 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,031 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 7 ; #P = 0,030 COL1A1-EVs vs Saline, **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 14 ; **P = 0,008 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 21 ; *P = 0,025 COL1A1-EV MN vs Solution saline au jour 28 ; **P = 0,006 COL1A1-EV MN contre solution saline au jour 35 ; #P = 0,031 COL1A1-EV contre solution saline, *P = 0,030 COL1A1-EV MN contre solution saline au jour 42 ; #P = 0,044 COL1A1- EVs vs Saline, *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 49 ; *P = 0,016 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 56 ; #P = 0,017 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,020 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 63 ; *P = 0,018 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 70 ; #P = 0,011 COL1A1-EVs vs Saline, **P = 0,006 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 77 ; #P = 0,028 COL1A1 -EVs vs Saline, *P = 0,037 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 84 ; #P = 0,043 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,043 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 91) et c, zone des rides sur le peau dorsale des souris pendant la fenêtre d'étude de 90 jours (n = 4 pour tous les groupes ; #P = 0,012 COL1A1-EVs vs Saline, **P = 0,005 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 7 ; #P = 0,010 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,048 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 14 ; #P = 0,023 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,021 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 21 ; *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 28 ; *P = 0,046 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 35 ; #P = 0,019 COL1A1-EVs vs Saline, **P = 0,009 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 42 ; #P = 0,042 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,030 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 49 ; *P = 0,030 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 63 ; *P = 0,029 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 70 ; #P = 0,048 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,022 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 77 ; #P = 0,040 COL1A1-EVs vs Saline, *P = 0,027 COL1A1-EV MN vs Saline au jour 84 ; *P = 0,045 COL1A1-EV MN vs solution saline au jour 91). Toutes les données proviennent de trois expériences indépendantes et sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons en (b, c).

Méthodes supplémentaires, résultats et discussion, matériaux, figures, tableaux et références.

Micro-aiguilles délivrant des VE HA sur la peau de la souris.

Évolution temporelle ex vivo de la dissolution des pointes de micro-aiguilles délivrant des VE HA dans la peau.

Springer Nature ou son concédant (par exemple une société ou un autre partenaire) détient les droits exclusifs sur cet article en vertu d'un accord de publication avec le ou les auteurs ou autre(s) titulaire(s) des droits ; l'auto-archivage par l'auteur de la version manuscrite acceptée de cet article est uniquement régi par les termes de cet accord de publication et la loi applicable.

Réimpressions et autorisations

You, Y., Tian, ​​Y., Yang, Z. et al. Vésicules extracellulaires encapsulant l'ARNm délivrées par voie intradermique pour la thérapie de remplacement du collagène. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

Télécharger la citation

Reçu : 01 avril 2022

Accepté : 18 novembre 2022

Publié: 12 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-00989-w

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt